PCR için DNA tabanlı ürün amplifikasyon astar bir çift kullanılmış.:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Каждая ПЦР-смесь конечным объёмом 25 мкл содержала: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы и плазмидную ДНК-матрицу в количестве 25 нг. PCR sıcaklık kontrolü:
ilk denatürasyon 94° c – 3 мин.;
30 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
PCR- Ürün astar ve PCR reaksiyon bileşenleri SiO2-manyetik parçacıklar kullanarak Temizleme kiti kullanılarak saflaştırıldı ("Silex", Rusya) üreticinin önerilerini uygun olarak. Использовали 10 мкл магнитных частиц с ёмкостью связывания 10 мкг ДНК. Элюцию ДНК осуществляли в объёме 50 мкл буфера для элюции.
Шаг 2. MŠÈI spektrum DNA ürün elde.
Каплю водного раствора ПЦР-продукта в объёме 25 мкл наносили на чистое предметное стекло и использовали для зондирования лучом гелий-неонового лазера ЛГН-303 от 3 мин. Ve üzeri. İkincil modüle edilmiş geniş bant elektromanyetik radyasyon alınan (mŠÈI) записывали транзисторным радиоприемником на частоте 700 кГц и переводили в звук в формате wave. Bu ses dosyasını öneririz DNA bilgi tanıtmak için kullanın (kullanımı olmadan, Bu sürümü, Lazer LGN-303) örnekleri steril su, aklınızda bulunması, Bu ses burulma http bilgi taşıyabilir://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , DNA içeren (hipotez).
На расстоянии 15-20 см от лазера помещали штатив с пробирками, saf içeren distile su kirleri DNA olmadan, RNA ve nukleaz. -20 ° c ve razmorožena oda sıcaklığında su daha önce dondurulmuş (su eritmek).
Шаг 3. Su numuneleri kullanılarak PCR güçlendirme, Özgün DNA dizi mŠÈI işlenen, hangi bilgi okumada lazer LGN-303
Lazer maruz kaldıktan sonra su, işlenmiş mŠÈI aralığı, использовали для постановки стандартных ПЦР-реакций объёмом 25 мкл без добавления вещественной ДНК-матрицы. Штатив с пробирками размещали на расстоянии 20-30 см от лазера. Steril kutusunda yapılan PCR reaksiyonları yerleştirme, UV ışık işlenen, örnekleri kirlenme engelleyen.
Bulunan her PCR karışımı: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq DNA polimeraz. Çeşitli sıcaklık PCR kullanılan, farklı uzama süresi aşaması (sentez) DNA iplikçiklerinin 72° c.
Dahil özgün PCR sıcaklık kontrolü:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
Değiştirilmiş PCR sıcaklık kontrolü dahil:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 2-7 мин.;
завершающий синтез при 72°С в течение 5-7 минут.
Bütün sıcaklık rejimleri liderliğindeki belirtilen PCR ürünü sentezi uzunluğu, Ama değişen derecelerde,. Самое большое количество экспериментальных образцов целевого продукта наблюдали с использованием 7-минутного синтеза цепей ДНК в каждом из 40 циклов ПЦР.
Шаг 4. PCR sonuçlarının analizi
Jel için arabellek ile karışık PCR reaksiyon örnekleri tamamlanmasından sonra, Floresan boya içeren SYBR yeşil ben ("Silex", Rusya) и анализировали в 1,5 % агарозном геле по стандартной методике проведения гель-электрофореза в однократном ТВЕ-буфере. Результаты анализировали на трансиллюминаторе с длиной волны 365 нм. Olumlu düşünce örnekleri, başlangıç benzer bir mesafede olan bantlar, Bu ve şerit pozitif kontrol, соответствующего размеру ДНК-фрагмента 547 п.н.
Deneysel örnekleri sıralama için tabi tutuldu, pozitif kontrol PCR ile DNA örnekleri, kaynak ürün örnekleri, Lazer okuma yapıldığı ile. Ortaya sıralama, что экспериментальные образцы на 99,2-100% идентичны исходной последовательности ДНК-продукта, Lazer okuma yapıldığı.
Deneylerimiz birinin bir örnek olarak, resim PCR DNA hayaletler görmek. Ayrıca, 700kGc mŠÈI DNA frekansta dalga formatında kayıt ses sağlar.
Ses kayıt dalga biçimi DNA indirmek için bir link
Звук 547 п.н. [düğme bağlantısı =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ metin =”Download”]
PS: Bizim deneylerin lazer kullanarak olmadan oynayabilirsiniz. Ve orijinal DNA matris olmadan (Ayrıca yaptığımız gibi), Yani. matris sentez değil. Bu su tüpleri ile çalışma özgün DNA'ın yanlışlıkla kapatma karşı sağlar, Pipetler, vb.. Böylece biz kontaminacij gitmek. В таком варианте работающий плеер звука устанавливаем на расстоянии от 1 до 20 см от штатива с пробирками. Время воздействия можно варьировать от 5 минут и выше. Kimlik DNA PCR ürünü oluşmuş ve özgün DNA sıralama DNA elde ayarlayabilirsiniz. Test bu sürümünde yeterli astar ve bilgi tutarlılığı
Özgün DNA nükleotit.
Gariaev PP.
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN ve listesi, ÇAY KAŞIĞI. New York tr.
Kuantum genetik Enstitüsü bilimsel Direktörü
