För PCR används amplifiering av DNA-baserad produkt ett par av grundfärger:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Varje PCR-blandning med en slutlig volym på 25 | il innehöll: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 vid 25 ° C; 2,5 mM magnesiumklorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; blandning av dNTP vid en total koncentration av 300 μM; grundblandning 0,5 μM vardera; 2,5 enheter. Taq DNA-polymeras och plasmid-DNA-mall i en mängd av 25 ng. PCR temperaturkontroll ingår:
inledande denaturering 94° c – 3 min.;
30 cykler: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s;
slutlig syntes vid 72 ° C i 5 minuter.
PCR- produkten renades från primers och PCR reaktionen komponenter med hjälp av rengöring kit använder SiO2-magnetiska partiklar ("Silex", Ryssland) i enlighet med tillverkarens rekommendationer. Används 10 μl magnetiska partiklar med en bindningskapacitet på 10 μg DNA. DNA eluerades i en volym av 50 | il elueringsbuffert.
Steg 2. Att få mŠÈI spektrum DNA produkt.
En droppe av en vattenlösning av PCR-produkten i en volym av 25 | il applicerades på ett rent glasglas och användes för sondering med en LGN-303 heliumneon-laserstråle under 3 minuter.. Och ovan. Fick sekundära modulerade elektromagnetiska bredbandsstrålning (mŠÈI) inspelad med en transistorradiomottagare med en frekvens på 700 kHz och omvandlas till ljud i vågformat. Denna ljudfil, föreslår vi att du använder att införa DNA-information (utan användning av, Denna version av den, Laser LGN-303) i prover sterilt vatten, med tanke på, att ljudet kan bära vridning http information://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , inklusive DNA (hypotes).
Ett rack med provrör placerades på ett avstånd av 15-20 cm från lasern, som innehåller renat destillerat vatten utan orenheter DNA, RNA och nukleaz. Vattnet var tidigare frysas vid-20 ° c och razmorožena vid rumstemperatur (smälta vatten).
Steg 3. PCR-amplifiering med prover av vatten, bearbetade mŠÈI utbud av ursprungliga DNA, där behandlingen information laser LGN-303
Efter exponering för laser vatten, bearbetade mŠÈI utbud, används för att ställa in standard PCR-reaktioner i en volym av 25 | il utan att lägga till en riktig DNA-matris. Ett rack med provrör placerades på ett avstånd av 20-30 cm från lasern. Utsläppande av PCR-reaktioner utförs i steril låda, bearbetade UV-ljus, som förhindrar kontaminering av proverna.
Varje PCR blandning som finns: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 vid 25 ° C; 2,5 mM magnesiumklorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; blandning av dNTP vid en total koncentration av 300 μM; grundblandning 0,5 μM vardera; 2,5 enheter. Taq DNA-polymeras. Används flera temperatur PCR, olika längd fasen av töjning (syntesen) delar av DNA vid 72° c.
Den ursprungliga PCR temperaturkontroll ingår:
initial denaturering vid 94 ° C - 3 min.;
40 cykler: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s;
slutlig syntes vid 72 ° C i 5 minuter.
Modifierade PCR temperaturkontroll ingår:
initial denaturering vid 94 ° C - 3 min.;
40 cykler: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 2-7 min.;
slutlig syntes vid 72 ° C i 5-7 minuter.
Alla temperatur regimer ledde till syntesen av PCR-produkten anges längden, men i varierande grad,. Det största antalet experimentprover av målprodukten observerades med användning av 7-minuters syntes av DNA-strängar i var och en av 40 PCR-cykler.
Steg 4. Analys av resultaten av PCR
Efter slutförandet av PCR reaktionen proverna blandas med buffert för gel, innehållande fluorescerande färgämne SYBR Green jag ("Silex", Ryssland) och analyserades i 1,5% agarosgel enligt standardmetoden för gelelektrofores i en enda TBE-buffert. Resultaten analyserades på en 365 nm transilluminator. Positiv tanke prover, band som var på liknande avstånd från början, som och Strip positiv kontroll, motsvarande storleken på DNA-fragmentet 547 bp.
Experimentprover utsattes för sekvensering, positiv kontroll prover PCR och DNA prover, source produkt, med som gjorde behandlingen laser. Sekvensering avslöjade, de experimentella proverna vid 99,2-100% identisk med den ursprungliga DNA-produktsekvensen, som gjorde behandlingen laser.
Som en illustration av en av våra experiment, se bild PCR DNA fantomer. Ljudinspelning mŠÈI DNA i wave-format på frekvensen 700kGc ger också.
Länk för att ladda ner inspelning av ljud våg format DNA
Ljud 547 bp. [knappen link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ text =”Hämta”]
PS: Våra experiment, kan du spela utan att använda laser. Och utan den ursprungliga DNA matrisen (som vi också gör), dvs.. inte syntetisera matris. Detta säkerställer mot oavsiktlig stängning av den ursprungliga DNA i arbetar med vatten rör, i Pipetter, etc.. Därmed går vi från kontaminacij. I den här versionen installeras en fungerande ljudspelare på 1 till 20 cm avstånd från racket med provrör.. Exponeringstiden kan variera från 5 minuter och mer. Identitet bildas DNA PCR-produkten och den ursprungliga DNA sekvensering DNA erhålls kan ställas in. I denna version av testet tillräckligt primers och kunskap konsekvens
ursprungliga DNA nukleotider.
Gariaev P.p..
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN och lista, TSK. New York sv.
Vetenskaplig direktör vid Institutet för quantum genetik
