Pentru PCR amplificare de produs pe bază de ADN-ul a folosit o pereche de grunduri:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Каждая ПЦР-смесь конечным объёмом 25 мкл содержала: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы и плазмидную ДНК-матрицу в количестве 25 нг. Controlul temperaturii PCR incluse:
denaturare iniţială la 94 ºC – 3 мин.;
30 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
PCR- produsul a fost purificat de grunduri si componente de reactia PCR utilizând kitul de curatare folosind particule magnetice de SiO2 ("Silex", Rusia) în conformitate cu recomandările constructorului. Использовали 10 мкл магнитных частиц с ёмкостью связывания 10 мкг ДНК. Элюцию ДНК осуществляли в объёме 50 мкл буфера для элюции.
Шаг 2. Obtinerea mŠÈI spectrul ADN-ul produsului.
Каплю водного раствора ПЦР-продукта в объёме 25 мкл наносили на чистое предметное стекло и использовали для зондирования лучом гелий-неонового лазера ЛГН-303 от 3 мин. Si mai sus. Primit secundar modulate de radiaţii electromagnetice în bandă largă (mŠÈI) записывали транзисторным радиоприемником на частоте 700 кГц и переводили в звук в формате wave. Acest fişier audio, vă sugerăm să utilizaţi pentru a introduce informaţii de ADN (fără a utiliza, Această versiune de, Laser LGN-303) în probele de apă sterilă, având în vedere, acel sunet pot transporta informaţiile de http torsiune://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , inclusiv ADN (ipoteza).
На расстоянии 15-20 см от лазера помещали штатив с пробирками, care conţin purificat distilat apă fără impurităţi ADN, ARN şi nukleaz. Apa a fost anterior congelat la-20 ° c şi razmorožena la temperatura camerei (se topesc apa).
Шаг 3. Amplificarea PCR, utilizând probe de apă, prelucrate mŠÈI gama de ADN-ul original, ce informaţii de lectură cu laser LGN-303
După expunerea la laser apa, gama mŠÈI prelucrate, использовали для постановки стандартных ПЦР-реакций объёмом 25 мкл без добавления вещественной ДНК-матрицы. Штатив с пробирками размещали на расстоянии 20-30 см от лазера. Introducerea a PCR reacţii efectuate în caseta de steril, prelucrate la lumină UV., care previne contaminarea probelor.
Fiecare amestec PCR cuprinse: 67 мМ трис-HCl pH 8,6 при 25°С; 2,5 мМ хлорид магния; 16,6 мМ сульфат аммония; смесь dNTPs в суммарной концентрации 300 мкМ; смесь праймеров по 0,5 мкМ каждого; 2,5 ед. Taq ADN polimeraza. Folosite mai multe temperatura PCR, diferite durata fazelor de alungire (sinteza) direcţii de acţiune ale ADN-ului la 72° c.
Original control al temperaturii de PCR, inclus:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 40 с;
завершающий синтез при 72°С в течение 5 минут.
Modificat PCR controlul temperaturii incluse:
первоначальная денатурация при 94°С – 3 мин.;
40 циклов: 94°С – 30 с, 62°С – 30 с, 72°С – 2-7 мин.;
завершающий синтез при 72°С в течение 5-7 минут.
Toate regimuri de temperatura a dus la sinteza a produsului PCR specificat lungimea, dar în grade diferite,. Самое большое количество экспериментальных образцов целевого продукта наблюдали с использованием 7-минутного синтеза цепей ДНК в каждом из 40 циклов ПЦР.
Шаг 4. Analiza rezultatelor a PCR
La terminarea probelor reactia PCR amestecat cu tampon pentru gel, care conţine colorant fluorescent SYBR verde I ("Silex", Rusia) и анализировали в 1,5 % агарозном геле по стандартной методике проведения гель-электрофореза в однократном ТВЕ-буфере. Результаты анализировали на трансиллюминаторе с длиной волны 365 нм. Probele pozitive gândire, trupe care au fost la o distanţă similară din start, că şi martorul pozitiv Strip, соответствующего размеру ДНК-фрагмента 547 п.н.
Specimene experimentale au fost supuse secventiere, Martorii pozitivi probele probele PCR şi ADN-ul, produs de sursa, cu care a făcut lectură cu laser. Secvenţiere a relevat, что экспериментальные образцы на 99,2-100% идентичны исходной последовательности ДНК-продукта, ceea ce a făcut lectură cu laser.
Ca o ilustrare a unul dintre experimentele noastre, a se vedea poze pentru PCR ADN fantome. Sunet mŠÈI ADN-ul de înregistrare în format wave pe frecvenţa 700kGc oferă, de asemenea.
Link pentru a descărca înregistrare sunet val format ADN
Звук 547 п.н. [Butonul link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ text =”Descarca”]
PS: Experimentele noastre, poţi să te joci fără ajutorul laser. Şi fără matricea ADN-ul original (cum facem, de asemenea), adică. sintetizeze matricea. Acest lucru asigură împotriva închiderii accidentale de ADN-ul original în lucrul cu tuburi de apă, Pipete, etc.. Astfel vom merge la kontaminacij. В таком варианте работающий плеер звука устанавливаем на расстоянии от 1 до 20 см от штатива с пробирками. Время воздействия можно варьировать от 5 минут и выше. Identitatea produsului PCR ADN format şi original ADN secvenţierea ADN obţinute pot fi setate. În această versiune de test suficient de grunduri şi coerenţa de cunoştinţe
nucleotide ADN-ul original.
Gariaev P.p..
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN şi lista, LINGURITA. New York ro.
Directorul ştiinţific al Institutului cuantică genetica
