PCR brukt forsterkning av DNA-baserte produktet et par primere:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Hver PCR-blanding med et sluttvolum på 25 ul inneholdt: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 ved 25 ° C; 2,5 mM magnesiumklorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; blanding av dNTPer med en total konsentrasjon på 300 μM; grunning bland 0 hver,5 μM hver; 2,5 enheter. Taq DNA-polymerase og plasmid-DNA-mal i en mengde på 25 ng. PCR temperaturkontroll inkludert:
første rødsprit 94° c – 3 min.;
30 sykluser: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s;
endelig syntese ved 72 ° C i 5 minutter.
PCR- produktet var renset fra grunning og PCR reaksjon komponenter ved hjelp av rengjøringssett med SiO2-magnetiske partikler ("Silex", Russland) i henhold til produsentens anbefalinger. Brukte 10 ul magnetiske partikler med en bindingskapasitet på 10 ug DNA. DNA ble eluert i et volum på 50 ul elueringsbuffer.
Steg 2. Få mŠÈI spectrum DNA-.
En dråpe av en vandig løsning av PCR-produktet i et volum på 25 μL ble påført en ren glasssklie og brukt til sondering med en LGN-303 helium-neon laserstråle i 3 min.. Og over. Mottatt sekundære modulert bredbånd elektromagnetisk stråling (mŠÈI) innspilt med en transistor radiomottaker med en frekvens på 700 kHz og konvertert til lyd i bølgeformat. Denne lydfil, foreslår vi at du bruker å innføre DNA informasjon (uten bruk av, Denne versjonen av den, Laser LGN-303) i prøver sterilt vann, å ha i tankene, at lyden kan bære torsjon http informasjon://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , inkludert DNA (hypotese).
Et stativ med prøverør ble plassert i en avstand på 15-20 cm fra laseren, inneholder renset destillert vann uten urenheter DNA, RNA og nukleaz. Vannet var tidligere frosset på 20 ° c og razmorožena ved romtemperatur (smelte vann).
Trinn 3. PCR forsterkning utvalg av vann, behandlet mŠÈI rekke opprinnelige DNA, hvilken informasjonen laser LGN-303
Etter eksponering for laser vann, behandlet mŠÈI rekkevidde, brukes til å sette opp standard PCR-reaksjoner med et volum på 25 ul uten å tilsette en ekte DNA-matrise. Et stativ med prøverør ble plassert i en avstand på 20-30 cm fra laseren. Plassering av PCR reaksjoner utført i sterilt boksen, behandlet UV-lys, som hindrer kontaminering av prøver.
Hver PCR blanding inneholdt: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 ved 25 ° C; 2,5 mM magnesiumklorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; blanding av dNTPer med en total konsentrasjon på 300 μM; grunning bland 0 hver,5 μM hver; 2,5 enheter. Taq DNA utvalg. Brukt flere temperatur PCR, ulik varighet fase av forlengelse (syntese) DNA-tråder ved 72° c.
Den opprinnelige PCR temperaturkontroll inkludert:
innledende denaturering ved 94 ° C - 3 min.;
40 sykluser: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 40 s;
endelig syntese ved 72 ° C i 5 minutter.
Modifisert PCR temperaturkontroll inkludert:
innledende denaturering ved 94 ° C - 3 min.;
40 sykluser: 94 ° C - 30 s, 62 ° C - 30 s, 72 ° C - 2-7 min.;
endelig syntese ved 72 ° C i 5-7 minutter.
Alle temperatur regimer førte til syntesen av PCR-produktet som er angitt lengde, men i varierende grad,. Det største antallet eksperimentelle prøver av målproduktet ble observert ved bruk av 7-minutters syntese av DNA-tråder i hver av 40 PCR-sykluser.
Trinn 4. Analyse av resultatene av PCR
Etter ferdigstillelse av PCR reaksjon prøvene blandet med bufferen for gel, med fluorescerende farge SYBR grønne jeg ("Silex", Russland) og analysert i 1,5% agarosegel i henhold til standardmetoden for gelelektroforese i en enkelt TBE-buffer. Resultatene ble analysert på en 365 nm transilluminator. Positiv tanke prøver, band som var på en tilsvarende avstand fra starten, som og Strip positiv kontroll, tilsvarer størrelsen på DNA-fragmentet 547 bp.
Eksperimentelle prøver ble utsatt for sekvensering, positiv kontroll prøver PCR og DNA prøver, source produkt, med som gjorde lese laser. Sekvensering avdekket, de eksperimentelle prøvene på 99,2-100% identisk med den opprinnelige DNA-produktsekvensen, som gjorde lese laser.
Som en illustrasjon av en av våre eksperimenter, se bilde PCR DNA fantomer. Lydopptak mŠÈI DNA i digitallydformat på frekvensen 700kGc også gir.
Link til nedlasting lydopptak bølge format DNA
Lyd 547 bp. [knapp link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ tekst =”Last ned”]
PS: Våre eksperimenter, kan du spille uten å bruke laser. Og uten den opprinnelige DNA-matrisen (som vi også gjøre), dvs.. ikke syntetisere matrise. Dette sikrer mot utilsiktet nedleggelsen av opprinnelige DNA arbeider med vann rør, Pipetter, etc.. Dermed går vi fra kontaminacij. I denne versjonen er en fungerende lydspiller installert i en avstand fra 1 til 20 cm fra stativet med prøverør. Eksponeringstiden kan variere fra 5 minutter og mer. Identitet dannet DNA PCR produkt og opprinnelige DNA sekvensering DNA innhentet kan angis. I denne versjonen av testen nok primere og kunnskap konsistens
opprinnelige DNA nukleotider.
Gariaev hotellet.
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN og liste, TS. New York no.
Vitenskapelig direktør for Institutt for quantum genetikk
