Per PCR amplificazione del prodotto a base di DNA usata un paio degli iniettori:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Ogni miscela di PCR era 25 ul volume finale conteneva: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 a 25 ° C; 2,5 mM cloruro di magnesio; 16,6 mM solfato di ammonio; miscela di dNTP in concentrazione totale di 300 uM; miscela di primer a 0,5 uM ciascuna; 2,5 unità. Taq DNA polimerasi e il plasmide DNA stampo di 25 ng. Controllo di temperatura PCR incluso:
denaturazione iniziale a 94° c – 3 min.;
30 cicli: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 con;
sintesi finale a 72 ° C per 5 minuti.
PCR- il prodotto è stato purificato dagli iniettori e componenti di reazione di PCR utilizzando il kit di pulizia utilizzando particelle magnetiche-SiO2 ("Silex", Russia) in conformità con le raccomandazioni del produttore. Stiamo utilizzando 10 l di particelle magnetiche con legante capacità DNA 10 ug. L'eluizione del DNA è stata effettuata in un volume di 50 ul di tampone di eluizione.
step 2. Sempre mŠÈI spettro DNA prodotto.
Una goccia della soluzione acquosa del prodotto di PCR in un volume di 25 ul stato applicato ad un vetrino da microscopio pulito e usato per sondare fascio laser HeNe LGN-303 3 min. E sopra. Ha ricevuto la radiazione elettromagnetica a banda larga modulata secondaria (mŠÈI) registrato radio a transistor ad una frequenza di 700 kHz e convertiti in formato onda sonora. Questo file audio, si consiglia di che utilizzare per introdurre informazioni del DNA (senza l'uso di, Questa versione della, LGN-303 del laser) in acqua sterile campioni, avendo in mente, che il suono può trasportare informazioni http di torsione://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , compreso il DNA (ipotesi).
Ad una distanza di 15-20 cm dal treppiede laser con tubi disposto, acqua senza impurità DNA contenente purificato distillata, RNA e nukleaz. L'acqua è stato precedentemente congelato a-20 ° c e razmorožena a temperatura ambiente (acqua di fusione).
passaggio 3. Amplificazione di PCR utilizzando campioni di acqua, trattati mŠÈI gamma originale del DNA, le informazioni di lettura laser LGN-303
Dopo l'esposizione all'acqua del laser, gamma di mŠÈI trasformati, utilizzato per la produzione di reazioni PCR standard, 25 microlitri di volume senza l'aggiunta di DNA stampo reale. tubi treppiede posti ad una distanza di 20-30 cm dal laser. L'immissione di reazioni di PCR effettuati nella casella sterile, elaborati di luce UV, che impedisce la contaminazione dei campioni.
Ogni miscela PCR contenuta: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 a 25 ° C; 2,5 mM cloruro di magnesio; 16,6 mM solfato di ammonio; miscela di dNTP in concentrazione totale di 300 uM; miscela di primer a 0,5 uM ciascuna; 2,5 unità. La Taq DNA polimerasi. Utilizzato diverse temperatura PCR, diverse fase di durata dell'allungamento (sintesi) filamenti di DNA a 72° c.
Il controllo di temperatura PCR originale incluso:
denaturazione iniziale a 94 ° C - 3 min.;
40 cicli: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 con;
sintesi finale a 72 ° C per 5 minuti.
Controllo di temperatura PCR modificato incluso:
denaturazione iniziale a 94 ° C - 3 min.;
40 cicli: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 2-7 min.;
sintesi finale a 72 ° C per 5-7 minuti.
Tutti i regimi di temperatura portò alla sintesi del prodotto PCR specificato lunghezza, ma a livelli diversi,. è stato osservato il maggior numero di provini di prodotto atteso con 7 minuti sintesi del filamento di DNA in ciascuno dei 40 cicli di PCR.
step 4. Analisi dei risultati della PCR
Dopo il completamento dei campioni di reazione di PCR mescolato con un tampone per gel, contenenti il colorante fluorescente SYBR Green I ("Silex", Russia) e analizzati su 1,5% gel di agarosio mediante metodi standard di gel elettroforesi in TBE tampone singola. I risultati sono stati analizzati su un transilluminatore a 365 nm. Campioni di pensiero positivo, bande che erano ad una distanza simile dall'inizio, che e il controllo positivo di striscia, opportuno frammento di DNA di dimensioni 547 bp.
Campioni sperimentali sono stati sottoposti a sequenziamento, controllo positivo campioni campioni di DNA e di PCR, prodotto di origine, con che ha reso la lettura laser. Sequenziamento ha rivelato, I campioni sperimentali 99,2-100% identica alla sequenza di DNA del prodotto iniziale, che ha reso la lettura laser.
Come un'illustrazione di uno dei nostri esperimenti, vedere fantasmi del DNA PCR foto. Registrazione del DNA mŠÈI in formato wave sulla frequenza del suono 700kGc fornisce anche.
Link per scaricare la registrazione del suono wave formato DNA
Suono 547 o.n. [Pulsante link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ testo =”Scarica”]
PS: I nostri esperimenti, si può giocare senza l'utilizzo di laser. E senza la matrice originale di DNA (come facciamo anche), vale a dire. non sintetizzano matrice. In questo modo contro la chiusura accidentale del DNA originale nel lavorare con tubi di acqua, le pipette, ecc.. Così andiamo da kontaminacij. In questa forma di realizzazione, il lettore audio di lavoro impostata alla distanza fra 1 e 20 cm dalle provette con il treppiede. tempo di esposizione può variare tra 5 minuti e fino. Identità formata prodotto di PCR del DNA e DNA sequenziamento DNA originale ottenuto può essere impostato. In questa versione del test abbastanza primer e coerenza
nucleotidi del DNA originale.
Gariaev P.p..
D.b.s, ACAD.. RANS, RAMTN ed elenco, TSP. New York EN.
Direttore scientifico dell'Istituto di genetica di quantum
