Pour l'amplification PCR du produit ADN on a utilisé une paire d'amorces:
[5] ′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
[5] ′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Chaque mélange PCR était de 25 ul de volume final et il contenait: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 à 25 ° C; [2],5 mM de chlorure de magnésium; [16],6 mM de sulfate d'ammonium; le mélange de dNTPs à une concentration totale de 300 uM; le mélange d'amorces est à 0,5 uM pour chacun; [2],5 unités. l'ADN polymérase Taq et la matrice d'ADN plasmidique sont de 25 ng. le regime de regulation de la température PCR incluait:
la dénaturation initiale à 94° C – 3 min.;
suivi de 30 cycles: 94 ° C - 30s,, 62 ° C - 30s,, 72 ° C - 40s,;
synthèse finale à 72 ° C pendant 5 minutes.
PCR- a été purifié des amorces et des composants de réaction PCR à l'aide du kit de nettoyage, utilisant des particules magnétiques et SiO2 (« Silex », Russie) conformément aux recommandations du fabricant. Nous utilisons 10 ul de particules magnétiques avec une capacité de liaison 10 ug d'ADN. L'élution de l'ADN a été effectuée dans un volume de 50 ul de tampon d'élution.
étape 2. Production du spectre de Rayonnement Électromagnétique à Large Bande Modulé (REMLB) par l'ADN-produit.
Une goutte de la solution de produit aqueux PCR d'un volume de 25 ul a été appliqué sur une lame de microscope propre et irradié par le faisceau laser LGN-303 (He Ne) de 3 min . et plus. Le rayonnement radio secondaire reçu (REMLB) a été enregistré à l'aide d'un radio-transistor sur la fréquence de 700 kHz et convertie en format audio WAVE. Nous proposons d'utiliser ce fichier audio, pour introduire l'information ADN (sans l'utilisation , dans cette version du, laser LGN-303) dans des échantillons d'eau stérile , en ayant à l'esprit, que le son peut transporter les informations de torsion :http//www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , y compris l'information sur l'ADN (c'est une hypothèse).
A une distance de 15-20 cm du laser on a placé un trépied avec des tubes à essai, contenant une eau purifiée distillée, sans impuretés ADN, d'ARN ni de nucléases . L'eau a été précédemment congelé à -20 ° C puis décongelée à température ambiante (l'eau de fonte).
étape 3. Amplification par PCR en utilisant des échantillons d'eau, traitée par REMLB du spectre de l'ADN original, dont on avait prélevé l'information à l'aide du laser LGN-303
Après l'exposition au laser, l'eau, traitée par le spectre REMLB, est utilisée pour la production de réactions de PCR standard, d'un volume de 25 ul, sans ajout de l'ADN matériel initial. Le trépied avec ses tubes était placés à une distance de 20 à 30 cm du laser. La mise en œuvre des réactions PCR était réalisée dans un boxe stérile, qu'on avait préalablement traité aux UV, ce qui prévient la contamination des échantillons.
Chaque mélange PCR contenait: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 à 25 ° C; [2],5 mM de chlorure de magnésium; [16],6 mM de sulfate d'ammonium; le mélange de dNTPs à une concentration totale de 300 uM; le mélange d'amorces est à 0,5 uM pour chacun; [2],5 unités. ADN polymérase Taq. On a utilisé divers régimes de température pour dérouler les réactions PCR, qui différaient par durée de la phase d'élongation (de la synthèse) des chaines d'ADN à 72° c.
Le régime de température PCR initial incluait:
la dénaturation initiale à 94 ° C - 3 min.;
40 cycles: 94 ° C - 30s,, 62 ° C - 30s,, 72 ° C - 40s,;
synthèse finale à 72 ° C pendant 5 minutes.
Le régime modifié de température PCR incluait:
la dénaturation initiale à 94 ° C - 3 min.;
40 cycles: 94 ° C - 30s,, 62 ° C - 30s,, 72 ° C - 2-7 min.;
synthèse finale à 72 ° C pendant 5-7 minutes.
Tous les régimes de température conduisaient à la synthèse du produit PCR de la longueur spécifiée, mais à des degrés divers,. Le plus grand nombre de spécimens d'essai du produit attendu a été observé en utilisant une synthèse de brin d'ADN à 7 minutes dans chacun des 40 cycles de PCR.
étape 4. Analyse des résultats de la PCR
Après l'achèvement des réactions PCR, les produits étaient mélangés à la solution tampon pour l'appliquer sur un gel, contenant un colorant fluorescent SYBR Green I (« Silex », Russie) et analysé dans un 1,5% gel d'agarose par la méthode classique de l'électrophorèse sur gel, dans un tampon TBE unique. Les résultats ont été analysés sur un trans-illuminateur à 365 nm de longueur d'onde . On a compté comme positifs les échantillons, dont les bandes étaient situées à la même distance du début, que la bande de contrôle positif , correspondant à la taille du fragment d'ADN de 547 pb.
Les échantillons expérimentaux qui ont été soumis au séquençage, étaient ceux du contrôle positif des échantillons PCR et l'ADN, source du produit, qui avait été l'objet de lecture au laser. Le séquençage a révélé, que les échantillons expérimentaux étaient à 99,2-100% identique à la séquence d'ADN du produit initial, qui avait été "lue" au laser.
À titre illustratif de l'une de nos expériences, voir la photographie des fantômes de PCR d'ADN . Enregistrement REMLB d'ADN, au format WAVE, sur la fréquence porteuse de 700kHz est fourni également.
Un lien pour télécharger l'enregistrement sonore WAVE de l'ADN
(Son 547 pn) Звук 547 п.н. [bouton link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ texte=”télécharger”]
PS: Nos expériences peuvent être reproduites sans utiliser le laser. et sans la matrice d'ADN originelle (comme nous le faisons aussi), c'est à dire. en ne synthétisent pas de matrice. Cela garantit contre l'introduction accidentelle d'un ADN étranger dans les tubes à l'eau, dans les pipettes, etc... Ainsi nous nous protégeons de la contamination. Dans ce mode de réalisation, le lecteur audio de travail diffuse à une distance de 1 à 20 cm des tubes à essai sur le trépied. Le temps d'exposition peut varier de 5 minutes à plus. L'identité de l'ADN du produit PCR et l'ADN original peut être vérifiée par le séquençage de l'ADN obtenu par PCR. Dans cette version du contrôle il suffit de disposer des amorces et de la connaissance de la séquence
des nucléotides de l'ADN original.
Garaïev P.P..
Membre , de l'Académie. des Sciences Naturelles de Russie, de l'Académie Russe de Médecine et de l'Académie Internationale des Sciences Expérimentales, Membre de l'Académie des Sciences de. New York .
Directeur scientifique de l'Institut de génétique de quantique
