PCR vahvistuminen DNA-pohjainen tuote käyttää pari pohjamaalit:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Kukin PCR-seos sisälsi lopullisen tilavuuden 25 μl: 67 mM tris-HCl pH 8,6 25 °C:ssa; 2,5 mM magnesiumkloridia; 16,6 mM ammoniumsulfaatti; dNTP-seos, jonka kokonaispitoisuus on 300 μM; seos alukkeita 0,5 μM kukin; 2,5 yksikköä. Taq-DNA-polymeraasi ja plasmidi-DNA-templaatti 25 ng:n määränä. PCR lämpötilan mukaan:
ensimmäinen denaturointi 94° c – 3 minuuttia |;
30 sykliä: 94°С – 30 s, 62°С – 30 s, 72°С – 40 s;
lopullinen synteesi 72 ° C: ssa 5 minuutin ajan.
PCR- tuote oli puhdistettu pohjamaalit ja PCR reaktio komponenttien avulla käyttäen SiO2 magneettiset partikkelit puhdistussarja ("Silex", Venäjä) valmistajan suositusten mukaisesti. Käytettiin 10 μl magneettisia hiukkasia, joiden sitoutumiskyky oli 10 μg DNA: ta. DNA-elutio suoritettiin 50 μl: n eluutiopuskurin tilavuudessa.
Vaihe 2. Saada mŠÈI taajuuksien DNA tuote.
Pisara PCR-tuotteen vesiliuosta 25 μl: n tilavuudessa levitettiin puhtaalle levylle ja sitä käytettiin havaitsemiseen helium-neonlaser LGN-303: n säteellä 3 minuutista. Ja yli. Sai toisen moduloidun laajakaistaista säteilyä (mŠÈI) tallennetaan transistoriradiovastaanottimella taajuudella 700 kHz ja käännetään ääneksi aaltomuodossa. Äänitiedoston, suosittelemme käyttämään DNA-tiedot (käyttämättä, Tämä versio, Laser LGN-303) näytteet steriilissä vedessä, ottaa huomioon, että ääni voivat tehdä vääntö http tietoja:www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , myös DNA (hypoteesi).
15-20 cm: n etäisyydelle laserista sijoitettiin jalusta, jossa oli koeputket., sisältää puhdistettu tislattua vettä ilman epäpuhtauksien DNA, RNA ja nukleaz. Vesi oli aiemmin jäädytetty 20 ° c ja razmorožena huoneenlämmössä (sulaa vettä).
Vaihe 3. PCR vahvistus käyttäen vesinäytteiden, käsitellään mŠÈI erilaisia alkuperäinen DNA, reading tiedot laser LGN-303
Altistumisesta laser vettä, käsiteltyjen mŠÈI alue, käytetään tavanomaisten PCR-reaktioiden vaiheistamiseen 25 μl:n tilavuudella lisäämättä todellista DNA-templaattia. Koeputkilla varustettu jalusta sijoitettiin 20-30 cm: n etäisyydelle laserista. PCR reaktioita saattaa suorittaa steriili ruutuun, käsitellä UV-valossa, joka estää näytteiden kontaminaation.
Kullekin PCR seoksen: 67 mM tris-HCl pH 8,6 25 °C:ssa; 2,5 mM magnesiumkloridia; 16,6 mM ammoniumsulfaatti; dNTP-seos, jonka kokonaispitoisuus on 300 μM; seos alukkeita 0,5 μM kukin; 2,5 yksikköä. Taq DNA polymeraasiketjureaktio. Käyttää useita lämpötila PCR, erilaiset kesto vaiheen venymä (synteesi) osa DNA 72° c.
Alkuperäinen PCR lämpötilansäätö mukana:
alkuperäinen denaturointi 94 ° C: ssa - 3 min.;
40 sykliä: 94°С – 30 s, 62°С – 30 s, 72°С – 40 s;
lopullinen synteesi 72 ° C: ssa 5 minuutin ajan.
Muutettu PCR lämpötilansäätö mukana:
alkuperäinen denaturointi 94 ° C: ssa - 3 min.;
40 sykliä: 94°С – 30 s, 62°С – 30 s, 72°С - 2-7 minuuttia;
lopullinen synteesi 72 ° C: ssa 5-7 minuutin ajan.
Kaikkia lämpötila hallituksia johti PCR tuotteen määritetty pituus, mutta vaihtelevasti,. Suurin määrä kokeellisia näytteitä kohdetuotteesta havaittiin käyttäen DNA-ketjujen 7 minuutin synteesiä kussakin 40 PCR-syklissä..
Vaihe 4. Tulosten PCR
PCR reaktio näytteitä sekoitetaan puskuri geeli päätyttyä, sisältää fluoresoiva väri SYBR Valkoinen I ("Silex", Venäjä) ja analysoitu kohdassa 1,5% agaroosigeeliä geelielektroforeesin standardimenetelmän mukaisesti yhdessä TCE-puskurissa. Tulokset analysoitiin transilluminaattorilla, jonka aallonpituus oli 365 nm. Positiivinen ajatus näytteet, jotka olivat yhtä lähellä alusta, että ja Strip positiivista kontrollia, vastaa DNA-fragmentin kokoa 547 p.n..
Kokeellinen näytteitä joutuivat sekvensointi, positiivinen kontrolli näytteet PCR ja DNA-näytteet, lähdekoodin tuote, kanssa joka teki käsittelyssä laser. Sekvensointi paljasti, että kokeelliset näytteet 99,2-100% identtinen alkuperäisen DNA-tuotesekvenssin kanssa, joka teki käsittelyssä laser.
Esimerkkinä yksi meidän kokeissa Katso kuva PCR DNA phantoms. Äänitys mŠÈI DNA aaltomuodon taajuudella 700kGc tarjoaa myös.
Linkki Lataa äänitys aalto muoto DNA
Ääni 547 p.n. [nappilinkkiä =”http:files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ teksti =”Lataa”]
PS: Meidän kokeissa, voit pelata ilman käyttämällä laser. Ja ilman alkuperäinen DNA-matriisi (kuten teemme), eli. ei syntetisoida matriisi. Tämä takaa vastaan vahingossa sulkeminen alkuperäinen DNA työskentelystä boilerit, pipettejä, jne.. Näin ollen meidän siirtyä kontaminacij. Tässä versiossa toimiva äänisoitin asennetaan 1 - 20 cm: n etäisyydelle jalustasta koeputkilla.. Valotusaika voi vaihdella 5 minuutista tai enemmän. Identiteetti muodostuu DNA PCR-tuotteen ja alkuperäinen DNA sekvensointi DNA saatu voidaan asettaa. Tässä versiossa testi tarpeeksi pohjamaalit ja tiedon johdonmukaisuus
Alkuperäinen DNA nukleotidien.
Gariaev P.p..
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN ja luettelo, TL. New York Fi.
Tieteellinen johtaja Institute of quantum genetiikka
