For PCR bruges forstærkning af DNA-baserede produkt et par af primere:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Hver PCR-blanding var 25 ul slutvolumen indeholdt: 67 mM Tris-HCI pH 8,6 ved 25 ° C; 2,5 mM magnesiumchlorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; dNTP'er blandingen ved en total koncentration på 300 uM; primer mix til 0,5 uM hver; 2,5 enheder. Taq DNA-polymerase og plasmid DNA-template på 25 ng. PCR temperaturkontrol inkluderet:
indledende denaturering på 94° c – 3 min.;
30 cykler: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 med;
endelige syntese ved 72 ° C i 5 minutter.
PCR- produktet blev renset fra primere og PCR reaktion komponenter ved hjælp af rensesæt ved hjælp af SiO2-magnetiske partikler ("Silex", РОССИЯ) i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger. Vi bruger 10 l af magnetiske partikler med bindingskapacitet 10 ug DNA. Elueringen af DNA blev udført i et volumen på 50 ul elueringspuffer.
trin 2. Få mŠÈI spektrum DNA produkt.
En dråbe af den vandige PCR-produkt opløsning i et volumen på 25 ul blev påført et rent mikroskopobjektglas og anvendt til at probe stråle HeNe laser LGN-303 3 min. Og ovenstående. Modtaget sekundære moduleret bredbånd elektromagnetisk stråling (mŠÈI) indspillet transistorradio ved en frekvens på 700 kHz og konverteres til lydbølge format. Denne lydfil, foreslår vi, at du kan bruge til at indføre DNA-oplysninger (uden brug af, Denne version af den, Laser LGN-303) i prøver sterilt vand, at have i tankerne, at lyden kan bære torsion http-oplysninger://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , herunder DNA (hypotese).
I en afstand på 15-20 cm fra laseren stativ med rørene placeret, indeholder renset destilleret vand uden urenheder DNA, RNA og nukleaz. Vandet var tidligere frosset ved-20 ° c og razmorožena ved stuetemperatur (smeltevandet).
trin 3. PCR-amplifikation ved hjælp af stikprøver af vand, forarbejdede mŠÈI række oprindelige DNA, hvor læsning oplysninger laser LGN-303
Efter eksponering for laser vand, forarbejdede mŠÈI rækkevidde, anvendes til fremstilling af standard PCR-reaktioner, 25 pi i volumen uden at tilføje reel template-DNA. Tripod rør placeret i en afstand på 20-30 cm fra laseren. Markedsføring af PCR-reaktionerne udført i sterile boks, forarbejdet UV-lys, der forhindrer forurening af prøver.
Hver PCR blandingen indeholdt: 67 mM Tris-HCI pH 8,6 ved 25 ° C; 2,5 mM magnesiumchlorid; 16,6 mM ammoniumsulfat; dNTP'er blandingen ved en total koncentration på 300 uM; primer mix til 0,5 uM hver; 2,5 enheder. Taq DNA polymerase. Brugt flere temperatur PCR, forskellig varighed fase af brudforlængelse (syntese) DNA-strenge ved 72° c.
Den oprindelige PCR temperaturkontrol inkluderet:
indledende denaturering ved 94 ° C - 3 min.;
40 cykler: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 med;
endelige syntese ved 72 ° C i 5 minutter.
Modificerede PCR temperaturkontrol inkluderet:
indledende denaturering ved 94 ° C - 3 min.;
40 cykler: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 2-7 min.;
endelige syntese ved 72 ° C i 5-7 minutter.
Alle temperatur regimer førte til syntesen af PCR produktet angivne længde, men i varierende grad,. Det største antal prøveemner af det forventede produkt blev observeret ved anvendelse af en 7 minutters DNA-streng-syntese i hver af 40 PCR-cyklusser.
trin 4. Analyse af resultaterne af PCR
Efter afslutningen af PCR reaktion prøver blandet med buffer for gel, der indeholder fluorescerende farvestof SYBR Green jeg ("Silex", РОССИЯ) og analyseret på en 1,5% agarosegel ved standardfremgangsmåder af gelelektroforese i TBE buffer enkelt. Resultater blev analyseret på en transilluminator ved 365 nm. Positiv tanke prøver, bands, der var i en lignende afstand fra starten, der og Strip positiv kontrol, passende størrelse DNA-fragment på 547 bp.
Eksperimentelle prøver blev udsat for sekventering, positiv kontrol prøver PCR og DNA prøver, source-produkt, med hvilket gjorde læsning laser. Sekventering afsløret, Forsøgsprøverne 99,2-100% identiske med DNA-sekvensen af det oprindelige produkt, som gjorde læsning laser.
Som en illustration af en af vores eksperimenter, se billede PCR DNA spøgelser. Lyd optagelse mŠÈI DNA i wave format på frekvensen 700kGc også giver.
Link til at downloade lydoptagelse wave format DNA
Lyd 547 o.n. [Knappen link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ tekst =”Download”]
PS: Vores forsøg og, du kan spille uden brug af laser. Og uden at de oprindelige DNA matrix (som vi også gør), dvs.. ikke syntetisere matrix. Dette sikrer mod utilsigtet lukning af den oprindelige DNA i at arbejde med vandrør, pipetter, osv.. Dermed går vi fra kontaminacij. I denne udførelsesform arbejder den lydafspiller indstillet i en afstand fra 1 til 20 cm fra reagensglassene med trefoden. Eksponering tid kan variere mellem 5 minutter og op. Identiteten dannes DNA PCR produkt og den oprindelige DNA-sekventering DNA fremstillet kan indstilles. I denne version af testen nok primere og viden konsistens
oprindelige DNA-nukleotider.
Gariaev P.p..
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN og liste, TSK. New York da.
Videnskabelig direktør for Institute of quantum genetik
