Para PCR amplificación del producto basado en el ADN utiliza un par de iniciadores:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Cada mezcla de PCR fue de 25 ul volumen final contenía: mM Tris-HCl 67 pH 8,6 a 25 ° C; 2,cloruro de magnesio 5 mM; dieciséis,sulfato de amonio 6 mM; mezcla de dNTP a una concentración total de 300 uM; mezcla de cebadores a 0,5 uM cada; 2,5 unidades. polimerasa y el plásmido molde de ADN Taq ADN de 25 ng. Control de la temperatura de polimerización en cadena incluye:
desnaturalización inicial a 94° c – 3 min.;
30 ciclos: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 con;
síntesis final a 72 ° C durante 5 minutos.
POLIMERIZACIÓN EN CADENA- el producto se purificó de cartillas y componentes de la reacción de polimerización en cadena usando el kit de limpieza mediante partículas magnéticas de SiO2 ("Silex", Rusia) acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Estamos utilizando 10 l de partículas magnéticas con capacidad de unión a ADN 10 ug. La elución de ADN se realizó en un volumen de 50 ul de tampón de elución.
paso 2. Conseguir el producto de DNA de espectro mŠÈI.
Una gota de la solución acuosa producto de PCR en un volumen de 25 ul se aplicó a un portaobjetos de microscopio limpio y se utiliza para sondear LGN-303 haz de HeNe láser 3 min. Y arriba. Recibido radiación electromagnética banda ancha modulada secundaria (mŠÈI) grabada transistor de radio a una frecuencia de 700 kHz y convertida en formato de onda de sonido. Este archivo de audio, le sugerimos que utilice para introducir la información del ADN (sin el uso de, Esta versión de la, LGN-303 del laser) en el agua estéril de muestras, teniendo en cuenta, ese sonido puede llevar información de http de torsión://www.efir.com.ua/rus/a.php?r = 2&d = 69 , incluyendo ADN (hipótesis).
A una distancia de 15-20 cm desde el trípode láser con tubos colocados, agua sin impurezas de ADN que contienen purificada destilada, RNA y nukleaz. El agua fue previamente congelado a-20 ° c y razmorožena a temperatura ambiente (derretimiento de agua).
paso 3. Amplificación por PCR utilizando muestras de agua, procesado mŠÈI gama del ADN original, que información de lectura láser LGN-303
Después de la exposición al agua del laser, gama de transformados mŠÈI, utilizado para la producción de reacciones estándar de PCR, 25 l en volumen sin añadir ADN molde verdadero. tubos Trípode colocados a una distancia de 20-30 cm desde el láser. La comercialización de reacciones de PCR realizada en caja estéril, procesa la luz UV, que previene la contaminación de las muestras.
Cada mezcla PCR contenida: mM Tris-HCl 67 pH 8,6 a 25 ° C; 2,cloruro de magnesio 5 mM; dieciséis,sulfato de amonio 6 mM; mezcla de dNTP a una concentración total de 300 uM; mezcla de cebadores a 0,5 uM cada; 2,5 unidades. Taq ADN polimerasa. Utiliza la temperatura varios PCR, diferentes fase de duración del alargamiento (síntesis) filamentos de la DNA a 72° c.
El control de temperatura de polimerización en cadena original incluido:
desnaturalización inicial a 94 ° C - 3 min.;
40 ciclos: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 con;
síntesis final a 72 ° C durante 5 minutos.
Modificado control de la temperatura de la polimerización en cadena incluye:
desnaturalización inicial a 94 ° C - 3 min.;
40 ciclos: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 2-7 min.;
síntesis final a 72 ° C durante 5-7 minutos.
Todos los regímenes de temperatura condujeron a la síntesis del producto de PCR especificado longitud, pero en diferentes grados,. Se observó el mayor número de muestras de ensayo del producto esperado utilizando una síntesis de la cadena de ADN 7 minutos en cada uno de 40 ciclos de PCR.
paso 4. Análisis de los resultados de PCR
Después de la terminación de las muestras de reacción de PCR mezclado con tampón para el gel, que contiene colorante fluorescente SYBR Green I ("Silex", Rusia) y se analizaron en un 1,5% de gel de agarosa mediante métodos estándar de electroforesis en gel en tampón TBE sola. Los resultados se analizaron en un transiluminador a 365 nm. Muestras de pensamiento positivo, bandas que estaban a una distancia similar desde el inicio, y el control positivo de la tira, fragmento de ADN de tamaño adecuado de 547 pb.
Muestras experimentales fueron sometidas a la secuencia, control positivo de muestras muestras de PCR y ADN, producto de la fuente, con que hizo lectura del laser. Secuencia reveló, muestras experimentales que 99,2-100% idéntica a la secuencia de ADN del producto inicial, que hizo lectura del laser.
Como una ilustración de uno de nuestros experimentos, ver fantasmas de PCR DNA de imagen. Grabación mŠÈI ADN en formato de onda de la frecuencia de sonido 700kGc también proporciona.
Enlace para descargar la grabación de sonido onda formato DNA
Sonido 547 o.n. [botón de enlace =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ texto =”Descargar”]
PS: Nuestros experimentos, se puede jugar sin utilizar láser. Y sin la matriz del ADN original (como también hacemos), es decir. no sintetizan matriz. Esto asegura contra cierre accidental del ADN original en el trabajo con tubos de agua, las pipetas, etc.. Así pasamos de kontaminacij. En esta realización, el reproductor de audio conjunto de trabajo a una distancia de 1 a 20 cm de los tubos de ensayo con el trípode. El tiempo de exposición puede variar entre 5 minutos y hasta. Identidad formado producto de PCR de ADN y el ADN de secuencia de ADN original obtenido se puede establecer. En esta versión de la prueba de suficientes cartillas y consistencia de conocimientos
nucleótidos de ADN originales.
Gariaev P.p..
D.b.s., ACAD.. RANS, RAMTN y lista, TSP. Nueva York EN.
Director científico del Instituto de genética de quantum
