Für PCR verwendet Verstärkung von DNA-basierte Produkt ein paar Zündkapseln:
5′-CCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATC-3′;
5′-TGCCCGCTTCCAAACCAATGCCTAAAGA-3′.
Jedes PCR-Gemisch wurde 25 ul Endvolumen enthielt: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 bei 25 ° C; 2,5 mM Magnesiumchlorid; 16,6 mM Ammoniumsulfat; dNTPs Mischung bei einer Gesamtkonzentration von 300 & mgr; M; Primer-Gemisch auf 0,5 & mgr; M jeweils; 2,5 Einheiten. Taq-DNA-Polymerase und Plasmid-DNA-Matrize von 25 ng. PCR-Temperaturregelung enthalten:
anfängliche Denaturierung bei 94° c – 3 min.;
30 Zyklen: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 mit;
Endsynthese bei 72 ° C für 5 Minuten.
PCR- das Produkt wurde von Grundierungen und PCR-Reaktion-Komponenten mithilfe der Reinigungsset mit SiO2-Magnetpartikel gereinigt ("Silex", Russland) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Wir sind mit 10 l von magnetischen Teilchen mit Bindungskapazität 10 ug DNA. Die Elution von DNA wurde in einem Volumen von 50 ul Elutionspuffer durchgeführt.
Schritt 2. MŠÈI Spektrum DNA Produkt bekommen.
Ein Tropfen der wässrigen PCR-Produktlösung in einem Volumen von 25 ul wurde auf einen sauberen Mikroskop-Objektträger aufgebracht und verwendet, um Strahl HeNe Laser LGN-303 3 min zu sondieren. Und höher. Sekundären modulierten Breitband elektromagnetischen Strahlung empfangen (***) Transistorradio mit einer Frequenz von 700 kHz aufgenommen und umgewandelt in Schallwellen-Format. Diese Audiodatei, empfehlen wir Ihnen zur Einführung der DNA-information (ohne den Einsatz von, Diese Version von der, Laser-LGN-303) in den Proben sterilem Wasser, eingedenk, diesen Ton kann Verdrehung http Informationen tragen.://www.efir.com.ua/rus/a.php?R = 2&d = 69 , einschließlich DNA (Hypothese).
In einer Entfernung von 15-20 cm von dem Laser Stativ mit Rohren platziert, mit gereinigtes destilliertes Wasser ohne Verunreinigungen DNA, RNA und nukleaz. Das Wasser war zuvor bei-20 ° c und Razmorožena bei Raumtemperatur fixiert. (Wasser zu schmelzen).
Schritt 3. PCR-Verstärkung mit Proben des Wassers, mŠÈI Bereich der ursprünglichen DNA verarbeitet, die Leseinformationen laser LGN-303
Nach der Exposition zu Wasser laser, verarbeitete mŠÈI Bereich, für die Herstellung von Standard-PCR-Reaktionen, 25 & mgr; l Volumen, ohne Zugabe von echten Vorlage verwendet DNA. Stativrohre in eine Entfernung von 20-30 cm von dem Laser platziert. Das Inverkehrbringen von PCR-Reaktionen durchgeführt in sterilen Kasten, Verarbeitung von UV-Licht, die Kontamination der Proben verhindert.
Jeder PCR Mischung enthaltenen: 67 mM Tris-HCl pH 8,6 bei 25 ° C; 2,5 mM Magnesiumchlorid; 16,6 mM Ammoniumsulfat; dNTPs Mischung bei einer Gesamtkonzentration von 300 & mgr; M; Primer-Gemisch auf 0,5 & mgr; M jeweils; 2,5 Einheiten. Taq-DNA-polymerase. Verwendet mehrere Temperatur PCR, unterschiedliche Dauer der Phase der Dehnung (Synthese) DNA-Stränge auf 72° c.
Die ursprünglichen PCR-Temperaturregelung enthalten:
anfängliche Denaturierung bei 94 ° C - 3 min.;
40 Zyklen: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 40 mit;
Endsynthese bei 72 ° C für 5 Minuten.
Modifizierten PCR-Temperaturregelung enthalten:
anfängliche Denaturierung bei 94 ° C - 3 min.;
40 Zyklen: 94 ° C - 30,, 62 ° C - 30,, 72 ° C - 2-7 min.;
Endsynthese bei 72 ° C für 5-7 Minuten.
Alle Temperatur-Regime führte zur Synthese des PCR-Produktes angegebenen Länge, aber in unterschiedlichem Ausmaß,. Die größte Anzahl von Prüfkörpern des erwarteten Produkts wurde in jeder der 40 PCR-Zyklen unter Verwendung einer 7-minütigen DNA-Strang-Synthese beobachtet.
Schritt 4. Analyse der Ergebnisse der PCR
Nach der Fertigstellung der PCR Reaktion Proben gemischt mit Puffer für gel, mit fluoreszierenden Farbstoff SYBR Green I ("Silex", Russland) und auf einem 1 analysiert,5% Agarosegel durch Standardverfahren der Gelelektrophorese in TBE-Puffer einzige. Die Ergebnisse wurden auf einem Transilluminator bei 365 nm analysiert. Positive Gedanken-Beispiele, Bands, die in einem ähnlichen Abstand von Anfang an waren, Das und die Strip-Positivkontrolle, entsprechende Größe DNA-Fragment von 547 bp.
Experimentelle Proben wurden zur Sequenzierung unterzogen., Positivkontrolle Proben PCR und DNA-Proben, Source-Produkt, mit die Lesung laser gemacht. Sequenzierung ergab, Die experimentellen Proben 99,2-100% identisch mit der DNA-Sequenz des Ausgangsproduktes, die laser-Lesung gemacht.
Als Illustration eines unserer Experimente siehe Bild PCR DNA Phantome. Ton Aufnahme mŠÈI DNA im Wave-Format auf der Frequenz bietet 700kGc auch.
Link zum download der Tonaufnahme Welle Format DNA
Sound 547 O.N. [Taste link =”http://files.mail.ru/A59F39CE29C04CD180132D8885580905″ Text =”Download”]
PS: Unsere Experimente, die Sie spielen können, ohne mit laser. Und ohne die ursprüngliche DNA-Matrix (wie wir es auch tun), .. nicht Matrix synthetisieren. Dadurch wird sichergestellt, gegen versehentliche Schließung der ursprünglichen DNA im Umgang mit Wasser-Schläuche, die Pipetten, etc... Daher gehen wir vom kontaminacij. In dieser Ausführungsform arbeitet der Audio-Player in einem Abstand von 1 bis 20 cm aus den Reagenzgläsern mit dem Stativ. Die Belichtungszeit kann zwischen 5 Minuten variieren und bis. Identität gebildet DNA-PCR-Produkt und die ursprüngliche DNA Sequenzierung DNA erhalten kann eingestellt werden. In dieser Version des Tests genug Zündkapseln und Konsistenz
ursprüngliche DNA-Nukleotide.
Garyaev p.p..
D.b.s, DAS DRITTE. RANS, RAMTN und Liste, TSP. New York de.
Wissenschaftlicher Direktor des Instituts für Quanten Genetik
